(4)单因素试验
①离子液体种类对提取率的咪唑影响于100mL的两口圆底烧瓶中加入1.00g磨碎的未洗阴干沙棘叶,固液比为1∶20(g·mL-1),类离微波功率300W、液体叶总微波时间6min、沙棘微波温度60℃,黄酮考察溴化1-乙基-3-甲基咪唑的咪唑60%乙醇溶;液、溴化1-丁基-3-甲基咪唑的类离60%乙醇溶;液、溴化1-己基-3-甲基咪唑的液体叶总60%乙醇溶;液、溴化1-辛基-3-甲基咪唑的沙棘60%乙醇溶;液、溴化1癸基-3-甲基咪唑的黄酮60%乙醇溶;液、溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑的咪唑60%乙。醇溶液对沙棘叶中总黄酮提取率的类离影响,选择离子液体种类。液体叶总
②微波时间对提取率的沙棘影响称取1.00g未洗阴干沙棘叶粉末置于100mL圆底烧瓶中,乙醇浓度为60%,黄酮离子液体溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑浓度0.2mol·L-1,料液比1∶20(g·mL-1),分别在微波温度60℃,微波功率300W的条件下提取2min、4min、6min、8min、10min,选择最佳微波时间。
③微波功率对提取率的影响称取1.0g阴干沙棘叶粉末置于100mL圆底烧瓶中,乙醇浓度为60%,离子液体溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑浓度0.2mol·L-1,料液比1∶20(g·mL-1),微波时间4min、微波温度60℃,比较不同微波功率100W、200W、300W、400W、500W对沙棘叶中总黄酮提取率的影响。
④微波温度对提取率的影响称取1.00g未洗阴干沙棘叶粉末置于100mL圆底烧瓶中,乙醇浓度为60%,离子液体溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑浓度为0.2mol·L,料液比1∶20(g·mL-1),微波功率400W、微波时间4min,比较不同微波温度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃对沙棘叶中总黄酮提取率的影响。
⑤料液比对提取率的影响称取1.0g未洗阴干沙棘叶粉末置于100mL圆底烧瓶中,乙醇浓度为60%,离子液体溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑浓度为0.2mol·L-1,微波功率400W、微波时间4min、微波温度70℃,比较不同料液比1∶10(g·mL-1)、1∶15(g·mL-1)、1∶20(g·mL-1)、1∶25(g·mL-1)、1∶30(g·mL-1)对沙棘叶中总黄酮提取率的影响。
⑥离子液体浓度对提取率的影响
称取1.00g未洗阴干沙棘叶粉末置于100mL圆底烧瓶中,乙醇浓度为60%,微波功率400W、微波时间4min、微波温度70℃,料液比1∶20(g·mL-1),考察离子液体溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑浓度0.2mol·L-1、0.6mol·L-1、1.0mol·L-1、1.4mol·L-1、2.0mol·L-1对沙棘叶总黄酮提取率的影响。
(5)正交优化试验确定最佳提取工艺
参考单因素实验的结果设计L18(53)正交实验表,以微波时间、功率、温度,料液比,离子液体浓度为考察因素,探索沙棘叶总黄酮提取的最佳工艺。
(6)不同前处理方式对沙棘叶总黄酮的影响
于100mL圆底烧瓶中加入1.00g磨碎的未洗阴干沙棘叶,在不同条件下提取总黄酮,冷却后减压抽滤,滤饼用60%乙醇洗涤三次,所得滤液用60%乙醇定容到100mL容量瓶中。量取1mL提取液于25mL容量瓶中,然后加入显色剂,用60%的乙醇定容至刻度。以0mL提取液为参比,测定其吸光度值。三次平行试验后求平均值。在正交试验优化的提取条件下分别比较水洗阴干沙棘叶(6月份采摘)、未洗阴干沙棘叶(6月份采摘)、发酵阴干沙棘叶(6月份采摘)、炒干沙棘叶(6月份采摘)、蒸干沙棘叶(5月份采摘)、自然千晒沙棘叶(5月份采摘)、炒过沙棘叶(5月份采摘)对提取率的影响。
(7)沙棘叶总黄酮抗氧化活性试验
分别量取质量浓度为1.06mg·mL-1的未洗阴干沙棘叶提取液10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL,置于4mL具塞试管中,再分别加入590μL、580μL、570μL、560μL、550μL、540μL、530μL的lmol·L-1溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑的乙醇溶液,最后与300μL、5.29X10-2mg·mL-1的DPPH溶液混合,混合液摇匀后于避光环境下静置30min。以OμL的提取液做为参比,在492nm的波长下用酶标仪测定吸光度。DPPH自由基清除率=(A0一A样)/A0×100%,由线性回归方程得出其半数清除率IC50,即沙棘叶中总黄酮对DPPH自由基清除率达到50%时的有效浓度。
参考上述方法测定抗坏血酸溶液对DPPH自由基的清除率。比较沙棘叶总黄酮与抗坏血酸的半数清除率IC50,进而考察沙棘叶总黄酮的抗氧化活性。
二、结果讨论
1、离子液体种类对沙棘叶中总黄酮提取率的影响由图2可知,不同种类离子液体提取率大小顺序为f>e>d>a>b>C。离子液体烷基链越长,提取效果越好,一方面与离子液体对植物纤维素的溶解、溶胀有关,另一方面随着离子液体烷基链的增长,其极性变小,有利于沙棘叶总黄酮的溶出,当以溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑的乙醇溶液为提取剂时,整个提取剂的极性可能更接近黄酮的极性,沙棘叶总黄酮提取率最高。但离子液体烷基链超过12个碳后,发现离子液体自身水溶性变差,1mol·L-1Br的60%乙醇溶液配成后有不溶悬浮物,就没做进一步的提取探究。因此,后续均选定离子液体溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑进行试验。
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